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      新品上市丨還在苦苦思索實驗失敗原因? 這篇IHC秘籍快來收好!-北京博奧森生物技術有限公司
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      新品上市丨還在苦苦思索實驗失敗原因? 這篇IHC秘籍快來收好!
      發表者:北京博奧森生物      發表時間:2023-8-9


            免疫組織化學(Immunocytochemistry, IHC) 是一門利用抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色的技術,能夠對組織細胞內的抗原進行定位、定性及相對定量檢測,進而深入探究其功能。
            IHC實驗步驟繁瑣,包括切片制作(固定,脫水,透明,包埋,切片,貼片,烤片),脫蠟,水化,阻斷,抗原修復,封閉,一抗孵育,二抗孵育,顯色,復染,封片和分析等,每一個細節都可能影響到最終的染色結果。無論是從沒做過IHC的實驗小白,還是想要對當前方法進行優化的大牛,這篇秘籍都能讓您有所收獲。文末還附有IHC通關的秘密武器——Bioss全新上市的IHC即用型試劑盒,助您一次獲得文獻級的圖像結果。

      切片制作

      1.染色結果不理想,細胞核發灰模糊,對比不鮮明。
      解決方法:①半小時內完成取材,組織離體后盡快固定;
      ②固定液選擇視組織而定,有致密外膜用Carnoy液,活檢用Bouin液,固定液體積要超過組織體積5倍以上,量少應中途換液1~3次;
      2.蠟塊出現組織收縮凹陷,在抗原修復時脫片。
      解決方法:①梯度酒精脫水盡量徹底充分;
      ②二甲苯脫蠟時間不宜長,1~3 h最佳,脫蠟過度會導致組織發硬發脆;
      ③浸蠟應選擇低熔點的石蠟,并充分浸蠟;
      3.切片太厚,脫片,影響染色結果。
      解決方法:①切片厚度視組織而定,如同淋巴結、腎等組織需要比較?。ú怀^3 um),腦組織需要較厚(尤其是取新鮮標本冰凍制片時),6-8 um最佳,冰凍可切至10 um;其他一般如胃腸道、肝膽等等組織,2-4 um為宜,太厚易導致細胞重疊,影響觀察;
      ②切片角度和刀片新舊程度對切片效果的影響較大,切片角度視切片機型號而異,新刀片更易切出完好的切片;
      ③撈片要求一步到位,輕夾輕放,達到無皺折、無氣泡,水溫控制在40℃左右;
      ④粘片時玻片可用多聚賴氨酸或蛋白甘油處理,或選擇防脫片,以增強粘附性;
      4.染色不均勻。
      解決方法:①切片厚度不一致,需更換刀片,調整切片機狀態;
      ②試劑配制未混勻,導致局部濃度不一致,應將試劑充分混勻后滴加;
      ③在滴加試劑時讓試劑完全覆蓋組織;
      5.切片邊緣著色(邊緣效應)。
      解決方法:①組織邊緣與玻片粘貼不牢,邊緣組織松脫漂浮在液體中,每次清洗不易將組織下面試劑洗盡。玻片清洗干凈后應用APES或多聚賴氨酸處理,并確保組織切片盡量薄,盡量避免選用壞死較多的組織;
      6.目標蛋白定位異常。
      解決方法:①使用新鮮組織切片,
      ②固定不充分導致組織自溶,損壞,適當延長固定時間;
      ③根據組織大小,提高固定劑與組織的比例,切取小組織塊,浸泡固定更加充分;
      ④固定劑使用不當,根據目標蛋白和樣品組織性質選擇不同固定劑;
      ⑤優化固定條件,包括濃度、溫度、固定時間等;
      7.染色結果呈弱陽性。
      8.陽性檢測率及著色強度相對減弱,甚至無染色。
      解決方法:①固定液封閉了抗體識別表位,應縮短固定時間,增加抗原修復;
      ②靶蛋白含量低,建議增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號;
      ③靶蛋白為膜蛋白而表位可能因為滲透作用被破壞或移除,建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。
      ④組織較厚,建議做細胞破膜,以便抗體順利進入胞內與相應抗原結合。

      ③固定時間在4~24 h之間,長時間固定會影響抗原決定簇的暴露,且容易出現自發熒光及非特異性染色。

      ④抗原修復時,高壓時間過長,應適當縮短時間。

      ⑤烘干溫度為50℃,時間為12~24 h。

      ④脫蠟不完全,可更換脫蠟劑或延長脫蠟時間。

      ②切片上滴加的試劑未覆蓋均勻或未覆蓋到全部組織,邊緣的試劑少,容易變干,導致邊緣的試劑濃度比中心區域的高,而使得染色結果偏深。滴加試劑時要均勻且充分覆蓋到全部組織,為防止邊緣水分減少,滴加試劑時可以適當超出組織邊緣2 mm左右,保證組織部分覆蓋均勻。用組化筆畫圈時,距組織邊緣3-4 mm為宜,避免油劑對實驗結果的影響。

      ⑥抗原擴散,嘗試使用交聯固定劑而不是有機(醇類)固定劑。

      解決方法:①不當的固定方式或固定時溫度過高,影響待測抗原的數量和質量,應根據組織選擇更適宜的固定方式及溫度。


      抗原修復

      1. 陽性檢測率及著色強度相對減弱,甚至無染色。
      解決方法:①抗原修復緩沖液有多種,常用的有檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0),EDTA緩沖液(pH 8.0-9.0),Tris / Tris-EDTA緩沖液(pH 9.0-10.0),和胰酶(pH 3.5±0.2),修復液的PH值對染色結果的影響比較大,具體選擇應視情況而定;
      ②抗原修復不足,由于固定步驟引起的蛋白交聯導致抗原仍未被修復會導致染色減弱,需使用正確的抗原修復方法,如微波熱修復及高壓熱修復等;
      ③迅速冷卻,加熱結束后迅速用冷水澆淋使修復液急速降溫,可能造成抗原暴露不充分,且降溫太快,組織和載玻片的收縮系數不同易使組織脫片,應采用平緩冷卻,即讓修復液溫度平緩下降的方式。
      2.背景染色較深。
      解決方法:①固定過度,需摸索修復條件,改變抗原修復方法或減小抗原修復強度;
      ②抗原修復過程中,切片干涸。修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細,采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈,可以有效的避免液體流失,提高操作速度;
      3.結果出現弱陽。
      4.目標蛋白定位異常。
      解決方法:①抗原修復過強,導致組織結構被破壞,蛋白轉移。應優化抗原修復程序或嘗試不同的抗原修復方法,注意保留組織完整形態。

      ③避免切片在緩沖液或修復液中浸泡時間過長(大于 24 h)。

      解決方法:①不適當的抗原修復方式,導致抗原決定簇暴露不足,需摸索修復條件,改變抗原修復方法。

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